Serrapeptaasijauhe

Serrapeptaasi hydrolysoi sisäiset peptidisidokset ja hajottaa proteiinit pienemmiksi fragmenteiksi. Sen metalloproteaasiaktiivisuus sisältää sinkkiä katalyyttikohdassa, kun taas oikea proteiinin laskostuminen ja ympäristöolosuhteet edistävät entsyymien suorituskykyä.

Substraattitutkimuksissa voidaan käyttää kaseiinia, atsokeiinia tai määriteltyjä synteettisiä peptidejä, mutta nämä määritykset käsittelevät erilaisia ​​kysymyksiä. Kaseiinipohjaiset mittaukset arvioivat yleistä proteolyyttistä aktiivisuutta, kun taas synteettiset peptidit voivat auttaa karakterisoimaan katkaisupreferenssit ja entsyymikinetiikkaa. Monimutkaiset proteiinijärjestelmät, kuten biofilmimatriisit tai lima, vaativat sovelluskohtaisen arvioinnin.

Korkea kaseinolyyttinen aktiivisuus ei takaa vastaavaa aktiivisuutta jokaista biologista proteiinia vastaan. Tutkimuksen, johon liittyy fibriiniä, limaa tai solunulkoisen matriisin komponentteja, tulisi tutkia suoraan aiottu substraatti sen sijaan, että luottaisi pelkästään yleiseen proteaasimääritykseen.

Serrapeptaasi voidaan ottaa talteen ja puhdistaa mikrobiviljelyn jälkeen. Tutkimuksissa on tutkittu erilaisia ​​Serratia marcescens -kantoja ja puhdistusmenetelmiä, joihin sisältyy erotus, ultrasuodatus ja kromatografia. Rekombinanttiekspressiota ja solutonta proteiinisynteesiä on myös tutkittu.

Tuotantotutkimuksen tulisi arvioida enemmän kuin kokonaisproteiinisatoa. Asiaankuuluvia mittareita ovat liukoisen, aktiivisen entsyymin osuus; taitto ja kypsytys; aktiivisuuden palautuminen puhdistuksen aikana; aggregoituminen tai itsensä hajoaminen; ja erän konsistenssi.

Rekombinanttiproteiini, jolla on samanlainen molekyylimassa ja mitattavissa oleva kaseinolyyttinen aktiivisuus, ei ole automaattisesti ekvivalentti alkuperäisen entsyymin kanssa. Vertailuihin tulisi sisältyä sekvenssi- tai peptidikartoitus, katalyyttiset ominaisuudet ja stabiilisuus.

Solu- ja immunologisissa kokeissa isäntäsoluproteiineja, jäännösnukleiinihappoja ja endotoksiinia tulee kontrolloida tarpeen mukaan. Tällaiset epäpuhtaudet voivat vaikuttaa tulehdusarvoihin ja vaikeuttaa havaittujen vaikutusten liittämistä itse serrapeptaasiin.

Serrapeptaasin aktiivisuus ja stabiilisuus tulisi karakterisoida tietylle valmisteelle. Yhdelle kannalle ilmoitettuja optimaalisia olosuhteita ei pitäisi käsitellä kaupallisten jauheiden yleisinä spesifikaatioina.

Esimerkiksi AD-W2-peräinen valmiste osoitti optimaalista aktiivisuutta pH-arvoissa 9,0 ja 50 astetta, kun taas C8-peräinen valmiste osoitti optimia pH:ssa 6 ja 50 asteessa. Nämä havainnot syntyivät erilaisista entsyymivalmisteista ja määritysolosuhteista.

Optimaalinen reaktiolämpötila ja varastointistabiilisuus ovat erillisiä ominaisuuksia. Lämpötila, joka tukee korkeaa lyhytaikaista reaktionopeutta, voi silti aiheuttaa aktiivisuuden menetystä pitkäaikaisen altistuksen aikana. Näin ollen voimakas aktiivisuus 50 asteessa ei takaa soveltuvuutta pitkäaikaiseen lämmitykseen tai varastointiin.

Stabiilisuustutkimuksissa tulee tutkia kosteutta, liuoksen pH:ta, ionikoostumusta, pakastus-sulatusjaksoja, kuivausprosesseja ja apuaineiden yhteensopivuutta. Normaali jauheen ulkonäkö tai kirkas liuos ei voi korvata jäännösaktiivisuustestausta. Varastointilämpötilaa ja säilyvyyttä tulee tukea tuotekohtaisilla tiedoilla.

Serrapeptaasia on tutkittu Staphylococcus aureus -biofilmin muodostumisessa, pintakiinnittymisessä ja isäntäsolun adheesiossa. Vaikutukset voivat koskea proteiinipitoisia komponentteja tai kiinnittymiseen liittyviä prosesseja, mutta vähentynyt biofilmi ei välttämättä tarkoita, että bakteerit olisivat kuolleet.

Vuoden 2015 tutkimuksessa rakennettiin katalyyttisen kohdan mutantti, jolta puuttui havaittava proteolyyttinen aktiivisuus. Mutantti säilytti antibiofilmivaikutuksen testatuissa olosuhteissa, mikä viittaa siihen, että jotkin vasteet eivät ehkä ole täysin riippuvaisia ​​katalyyttisestä hydrolyysistä.

Siksi tutkijoiden tulisi erottaa toisistaan ​​alkukiinnittymisen estäminen, vähentynyt biofilmin kertyminen, vakiintuneiden biofilmien leviäminen, muuttunut bakteerien elinkelpoisuus ja muutokset isäntäsoluinvaasiossa.

Limaan liittyvässä serrapeptaasitutkimuksessa tulisi arvioida viskositeettia, elastisuutta ja puhdistumaan liittyvää toimintaa sen sijaan, että kaikki vasteet kuvattaisiin liman hajoamisena.

Vuoden 1988 nenä-limatutkimus raportoi dynaamisen viskositeetin vähentyneen tietyillä mittaustaajuuksilla, kun taas varastointimoduuli ei muuttunut merkittävästi. Tämä osoittaa, että viskositeetti ja elastisuus voivat reagoida eri tavalla; yhden parametrin parantaminen ei tarkoita parannusta jokaisessa reologisessa ominaisuudessa.

Olennaisia ​​päätepisteitä ovat viskositeetti, varastointimoduuli, hävikkimoduuli, musiini ja muut proteiinifragmentit sekä liman kuljetukseen tai puhdistumaan liittyvät mittaukset.

In vitro -kokeiden tulee hallita vesipitoisuutta, lämpötilaa ja ioniolosuhteita. Pelkkä laimentaminen voi vähentää viskositeettia, joten havaitut muutokset on erotettava entsyymiaktiivisuudesta johtuvista muutoksista.

Serrapeptaasia on tutkittu kliinisissä tutkimuksissa, joihin on liittynyt tulehdusta, leikkauksen jälkeistä turvotusta ja kipua. Tulokset tulee tulkita suhteessa formulaatioon, tutkimuspopulaatioon, vertailuun ja mitattuihin tuloksiin.

Vuoden 2013 systemaattisessa tarkastelussa tunnistettiin rajoituksia, kuten pienet otoskoot, heikko menetelmä, epätäydellisesti määritellyt tulokset sekä riittämättömät turvallisuus- ja pitkän aikavälin tiedot. Vaikka tämä katsaus ei kata kaikkea myöhempää tutkimusta, se varoittaa esittämästä kliinistä tehoa tiukasti vahvistettuna.

Mekanistisissa tutkimuksissa voidaan arvioida erikseen tulehdusvälittäjiä, verisuonten läpäisevyyttä, kudosturvotusta ja toiminnallisia muutoksia samalla kun seurataan solu- ja kudosvaurioita. Vähentyneet tulehdusmerkkisignaalit voivat myös heijastaa proteolyyttistä hajoamista tai määrityshäiriötä ja vaatia siksi validointia.